Система волоконной фотометрии для исследований FLiP

неврологияоптическое волокнофлуоресцентная

Обзор
RWD Fluorescence Lifetime Photometry System (FLiP) сочетает технологию Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) с волоконной фотометрией для мониторинга изменений времени жизни флуоресценции в мозге свободно движущихся животных в реальном времени. FLiP обеспечивает стабильные количественные in vivo измерения динамики нейромедиаторов, белок–белковых взаимодействий и конформационных изменений, используя время жизни флуоресценции (τ) — внутренний параметр, в значительной степени независимый от уровня экспрессии датчика, фотобличинга и артефактов движения.

Почему время жизни флуоресценции?

• Время жизни не зависит от концентрации фторофора и мощности возбуждения и отражает локальную микроокружение и конформационные изменения.
• Обеспечивает количественные сопоставимые между образцами показания без необходимости нормализации к базовой линии.
• Подходит для стабильных долгосрочных записей в исследованиях сна, моделях хронических заболеваний и продольных исследованиях.
• Обеспечивает чувствительное обнаружение динамических изменений аналитов с помощью сенсоров на основе времени жизни.

Два основных метода измерения

• Time-Domain (TCSPC): возбуждает образец импульсным светом и записывает временной распад флуоресценции. TCSPC фиксирует время прихода отдельных фотонов, строит гистограммы распада и извлекает времена жизни с помощью экспоненциальной аппроксимации. Обладает высокой временной разрешающей способностью и превосходным SNR при низком потоке фотонов; способен с высокой точностью разрешать несколько компонентов времени жизни.
• Frequency-Domain: возбуждает синусоидально модулированным непрерывным светом и выводит время жизни по фазовому сдвигу и глубине модуляции. Проще в реализации и быстро в приобретении данных, подходит для образцов с высоким потоком фотонов или систем без импульсных лазеров.

Сравнение (Time-Domain vs Frequency-Domain)

• Точность измерения времени жизни — Time-Domain (TCSPC): высокая; Frequency-Domain: хорошая
• SNR для слабо флуоресцирующих образцов — Time-Domain (TCSPC): отличный; Frequency-Domain: относительно ограничен
• Разрешение нескольких компонентов времени жизни — Time-Domain (TCSPC): высокая точность; Frequency-Domain: требует многочастотной модуляции или фейзер-анализа
• Скорость регистрации — Time-Domain (TCSPC): относительно быстрая; Frequency-Domain: быстрая
• Образцы с высоким потоком фотонов — Time-Domain (TCSPC): хорошо; Frequency-Domain: отлично
• Требование к лазеру — Time-Domain (TCSPC): импульсный лазер; Frequency-Domain: модулируемый источник непрерывного света

Ключевые особенности системы FLiP

• Стабильность системы разработана для минимизации флуктуаций состояния устройства и обеспечения надежных продольных сравнений.
• Низкий уровень системного шума для сохранения целостности данных при слабых сигналах.
• Возможность долгосрочных записей с минимальным дрейфом базовой линии в течение последовательных недель.
• Совместимость с широким спектром биосенсоров, работающих по принципу времени жизни флуоресценции.
• Прямая количественная аналитика: планируемая функция стандартной кривой для преобразования показаний времени жизни в оценки концентрации.

Примеры применения

• Измерения нейромодуляторов между животными и в хронической шкале времени: показания времени жизни (например, GRAB ACh3.0) остаются стабильными несмотря на вариации мощности лазера и экспрессии и позволяют различать поведенческие состояния.
• Механистические исследования генов риска психических расстройств: FLiP использовался для выявления аномальной динамики активности PKA в стриатуме у мышей с мутацией Akap11 при записях в свободном движении.
• Разработка и валидация новых сенсоров времени жизни: например, LifeCamp — кальциевый сенсор времени жизни, обеспечивающий абсолютное измерение переходных и базальных кальциевых сигналов в разных клеточных типах и при различных поведениях.

Характеристики / технические спецификации

• Общие характеристики системы
  • Варианты длины волны возбуждения: 488, 515, 560, 640, 670 nm (настраиваемые)
  • Частота импульсов: 1–80 MHz
  • Диапазон измерения времени жизни: 1–10 ns
  • Частота дискретизации: 1–50 Hz
  • Количество DIO: 8
  • Уровень напряжения: 3.3–5 V
  • Диаметр сердцевины оптического волокна: 200 или 400 µm
  • Числовая апертура (NA): 0.37
• Совместимость с биосенсорами времени жизни (примеры с длинами возбуждения)
  • Ca2+: Tq–Ca–FLITS — возбуждение ~439 nm; tr-CCaMP — ~437 nm; tr-GCaMP — ~493 nm; tr-RCaMP — ~563 nm; RCaMP1h — ~560 nm; LifeCaMP — ~488 nm
  • ACh (ацетилхолин): GRAB ACh3.0 — 488 nm; вариации GRAB FLIM-ACh — 515 nm; GRAB WHalo-ACh-1.0 (на основе красителя) — 565 nm / 680 nm (JF dyes)
  • DA (дофамин): dLight3.8 — 488 nm; GRAB FLIM-DA1.0 — 515 nm
  • PKA: tAKARα, tAKARβ, tAKARγ — 488 nm; FLIM-AKAR — 488 nm; GRAB FLIM-PKA — 515 nm
  • PKC: CKAR3 — 488 nm
  • Внеклеточный глутамат: Rncp-iGluSnFR1 — 560 nm
  • Серотонин (5-HT): sDarken — 488 nm
  • Норадреналин (NE): GRAB FLIM-NE1h / GRAB FLIM-NE1m — 515 nm; GRAB rNE3.0 — 560 nm; краситель‑насыщенный GRAB TMP-NE1.0 — ~690 nm; GRAB WHalo-NE — 565 nm / 680 nm (JF dyes)
  • 5-HT (альтернативный): GRAB FLIM-5-HT0.3 — 515 nm
  • CRF: GRAB rCRF1.0 — 570 nm
  • PACAP: GRAB rPACAP1.0 — 570 nm
  • Глюкоза: iGlucoSnFR-TS — 400 nm
  • Лактат: LiLac — 425 nm
  • АТФ: qMaLioffG — 488 nm